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24 September, 2017

La secuenciación “shotgun” es superada por la secuenciación por Amplicones

Por Catherine Offord | August 8, 2017

Según los investigadores, el enfoque de escopeta (shotgun), que generalmente se considera el método superior, puede subestimar de manera sustancial la diversidad en entornos que aún no han sido clasificados.

Dos métodos de secuenciación utilizados a menudo en los análisis de metagenómica dan resultados sorprendentemente diferentes cuando se aplican a comunidades microbianas relativamente poco estudiadas, según una investigación dirigida por un equipo del Museo Americano de Historia Natural (AMNH). El estudio, publicado el 31 de julio en Scientific Reports, encontró que la secuenciación de escopeta, generalmente considerada como el método superior para caracterizar comunidades microbianas, detectó una diversidad considerablemente menor que la secuencia de amplicones y frecuentemente omitió phyla completos cuando se aplica a muestras de bacterias de agua dulce.

El enfoque de amplicón relaciona las muestras con los taxa bacterianos conocidos basándose en una sola secuencia: la del gen altamente conservado para el ARNr 16S bacteriano. Por el contrario, la secuenciación de escopeta adopta un enfoque de genoma completo, dirigiendo secciones aleatorias de ADN bacteriano y uniendo el perfil resultante a una base de datos usando secuencias de genes comunes o genes marcadores específicos de clados.
Las comparaciones de los dos métodos en sistemas bien estudiados como el microbioma intestinal generalmente han encontrado que la secuenciación de escopeta identifica una mayor diversidad microbiana, un resultado atribuido a su dependencia de más de una parte del genoma, y ​​el volumen mucho mayor de datos que genera .

Pero al analizar los datos de un proyecto metagenómico en varios sitios de llanuras de inundación en Brasil, los miembros del equipo de AMNH se dieron cuenta que tenían suficientes muestras para realizar su propia evaluación a gran escala de los métodos en un sistema poco estudiado. “Pensamos, hey, podemos comparar el amplicón y la escopeta, vamos a hacerlo”, dice el coautor del estudio Michael Tessler, un recién graduado de la Escuela de Graduados Richard Gilder de la AMNH. “Pensábamos que la escopeta iba a ser igual o mejor”.

Para su sorpresa, sin embargo, los investigadores encontraron que la secuencia de escopeta recuperaba menos del 50 por ciento de los phyla identificados en las muestras de agua brasileñas por secuenciación de amplicones. Además, el enfoque de amplicón detectó un 27 por ciento más de familias, a pesar de usar solo una fracción del volumen de ADN.

“Es bastante asombroso”, dice Tessler, agregando que incluso la distribución de los taxa descubiertos por la secuenciación de escopeta fue diferente. “No solo hay menos phyla y familias, sino que solo hay unas pocas familias que realmente dominan la muestra”.

Los autores atribuyeron el bajo rendimiento de la secuencia de disparos principalmente a la debilidad de la base de datos utilizada en el estudio, en comparación con las bases de datos para el gen 16S rRNA. “Hemos estado secuenciando ese gen por mucho tiempo”, explica el coautor del estudio Mercer Brugler, investigador asociado en AMNH y profesor asistente de biología en NYC College of Technology. “Tenemos una gran base de datos para 16S”. En las bases de datos generalmente utilizadas para la secuenciación de escopeta, “la disponibilidad de genomas para consultar es bastante limitada para estos entornos únicos y remotos”.

El investigador de metagenómica y bioinformática Juan Jovel, de la Universidad de Alberta, expone esta interpretación. “Para entornos específicos, la integridad de las bases de datos determinará la eficacia con la que las secuencias bacterianas se pueden clasificar en taxa utilizando diferentes enfoques”, dice. Aunque los autores solo utilizaron un tipo de análisis para sus datos de escopeta, MetaPhlAn, una popular herramienta computacional también utilizada en el Proyecto del Microbioma Humano, los resultados subrayan el hecho de que “hay una gran diversidad de microorganismos en ambientes remotos”, dice Jovel. quien no participó en el presente estudio, “y recién estamos comenzando a explorar esa diversidad”.

De todos modos, Cole observa que cualquier evaluación de los métodos de escopeta debe tomarse en el contexto de un campo que está evolucionando muy rápidamente. “Todas estas herramientas están en constante estado de desarrollo”, dice. “Para cuando se publique algo en este campo, es probable que esté desactualizado”.

Brugler está de acuerdo en que es poco probable que los resultados actuales sean la última palabra. “Nuestros hallazgos van a cambiar”, dice, y agrega que el equipo también está planeando examinar otras bases de datos. “Escopeta, creo, se convertirá en la tecnología de referencia a medida que mejoren estas bases de datos. . . pero si se trata de un sistema no humano, no sé si todavía estamos listos para eso “.

Mientras tanto, el hecho de que los dos métodos mostraran resultados tan diferentes sugiere que los investigadores podrían ser prudentes para evitar el “exceso de confianza” en cualquier método, particularmente para sistemas menos estudiados, señala Tessler. “En ciencias, a menudo queremos una respuesta rápidamente”, dice. “Pero tomarse el tiempo para hacer un estudio piloto [con cada técnica de secuencia], incluso con algunas muestras, podría proporcionar mucha información sobre lo que cada uno de estos dos métodos podría hacer por usted. Vale la pena mostrar que hiciste tu diligencia debida “.

Fuente original: https://goo.gl/ZKQf6R

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