Secuenciación clásica

¿EN QUE CONSISTE?

Standard-seq Single
Es un proceso altamente automatizado para permitir el procesamiento rápido de plásmidos y productos de PCR. Las muestras pueden enviarse como clones, productos de PCR no purificados y ADN purificado.

Características fundamentales

  • Analizador de ADN 3730xl.
  • Monitoreo en tiempo real desde el registro hasta el envío de resultados mediante el uso de la herramienta LIMS (Laboratory Information Management System).
  • Desarrollo del servicio de análisis fundamental totalmente libre de cargo (gratis). Se investiga la homología en proteínas o nucleótidos a nivel de secuencia mediante el uso de BlastN o BlastX.

Preparación de las Muestras

  • Molde
    • Plásmido: Concentración: 100ng/ul, Volumen 20ul.
    • Producto de PCR (purificado): Concentración: 50ng/ul, Volumen 20ul.
    • Producto de PCR (no purificado): Concentración: 100ng/ul, Volumen 20-30ul, e.g. en caso de un producto de PCR de 300 pb, si nos envían 30ng/ul de la muestra se obtendrán mejores resultados (100pb: 10ng/ul). Se debe recomendar al cliente que revise su concentración de producto de PCR mediante una electroforesis en lugar de hacerlo con el Nano-drop.

Secuenciamiento Personalizado

Durante más de una década, Macrogen Inc. se ha dedicado a proporcionar soluciones genómicas a investigadores de todo el mundo con su avanzada tecnología de secuenciación de ADN mediante el uso de 23 ABI 3730XL. Gracias a los más de 10 años de experiencia y a la gran instalación de genómica, Macrogen Inc. es capaz de proporcionar el servicio de secuenciación para
cualquier persona o instituto al precio más competitivo. Desde reacciones de secuenciación a pequeña escala hasta grandes proyectos de secuenciación.

¿Cuándo debo solicitar este servicio?

Difícil secuenciación

Se especifica “secuenciación de plantillas de ADN difícil”para plantillas que no tienen éxito en la condición de secuenciación normal hecha por BigDye v.3.1, AB. Este servicio tiene diferente tasa de precio y está secuenciado con condiciones y reactivos personalizadas. Es posible que no obtenga secuencias esperadas dependiendo de las características de la muestra.

16s rRNA

A partir de células bacterianas, ofrecemos el servicio con todo incluido realizando la extracción de ADN, PCR, secuenciación y montaje. Se garantiza una secuencia de 1.300 pb o más para el dominio Bacter.

18S, ITS y 26S rRNA Secuenciación completa

Es cada vez más popular definir las especies mediante el uso de la información relacionada con la secuencia. Este servicio consiste en averiguar la secuencia del ARNr secuenciando el ADN correspondiente al ARNr. En caso de eucariotas, después de la secuenciación completa de rRNA, podemos descubrir la similitud del microorganismo del cliente con el microorganismo reportado en el NCBI. A partir de células fúngicas, ofrecemos el servicio todo incluído desde la extracción de ADN, PCR, secuenciación y montaje.

  • Análisis sobre secuencias de la región rRNA 18S; Longitud superior a1.600 pb garantizada.
  • Análisis de la región ITS (18S antes de la actualización); longitud superior a 500 pb garantizada.
  • Análisis de la longitud del gen del ARNr (región D1 / D2 / D3) superior a 1.300 pb garantizada.

Primer ambulante

Este servicio es leer 2-15kb de secuencia con el producto de PCR o el ADN del plásmido que no puede ser leído completamente mediante secuenciación de extensión simple de primer. Una vez realizada la secuenciación final con el primer diseñado por el cliente, Macrogen diseña los primers internos con referencia a los datos de secuencia final. El deambular necesario continúa con
el mismo método hasta que toda la región está cubierta. Toma cerca de una semana el proceso para leer 1-1.5kb por primer ambulante.

Análisis de fragmentos

El análisis de fragmentos abarca una amplia variedad de técnicas de genotipificación, identificación y mutación de ADN para la investigación médica, ambiental y agrícola. Macrogen Inc. proporciona el análisis de fragmentos basado en su amplia experiencia y conocimientos acumulados en genómica. En general, se utiliza sólo para el control de tamaño de fragmentos amplificados. Debido a que la amplificción por PCR no está disponible a través de este servicio, los productos de PCR marcados con fluorescencia deben ser suministrados como muestras de Análisis de Microsatélites (VNTR).

Aplicaciones del servicio:

  • Inestabilidad microsatélite
  • Análisis de polimorfismos de longitud de fragmento amplificado (AFLP)
  • Análisis de polimorfismos de longitud de fragmento de restricción de terminal (T-RFLP)
  • Cuantificación fluorescente relativa – Pérdida de heterocigosidad (LOH), ensayos de aneuploidía, y detección de deleción cromosómica grande.
  • El polimorfismo amplificado relacionado con la secuencia (SRAP) proporciona una herramienta útil para la estimación de la diversidad genética y las relaciones fenéticas en poblaciones naturales y domesticadas.

ID humano

El servicio de identificación humana es un servicio de análisis de ADN que utiliza el Kit Multiplex-PCR compuesto por loci STR (Short Tandem Repeat). Este servicio denominado Human ID Service permite el análisis de picos de calidad óptima usando productos de PCR y configurando la concentración adecuada antes de procesar en el 3730XL.

Clonación

Además del propósito principal de la clonación, podemos mejorar los resultados de la secuenciación a través de este servicio de clonación para productos de PCR contaminados que normalmente muestran picos dobles en el cromatograma. Este servicio se desarrolla así:,

  • Paso 1. Haciendo el plásmido insertando los productos de PCR de un cliente en el vector (vector T o vector Blunt)
  • Paso 2. Inserción del plásmido en una célula bacteriana para cultivo
  • Etapa 3. Extracción de células para los plásmidos
    Tenga en cuenta que el cliente debe informarnos que tipo de ADN polimerasa se utilizó en la PCR antes de enviar muestras ya que el vector para su uso depende totalmente de la existencia de pfu-taq en la ADN polimerasa.

Secuenciación de longitud completa de mtDNA humano

Se proporciona secuenciación directa de genes de ADN de mitocondrias humanas amplificadas de 16.659 pares de bases.

  • Realización de procesos completos incluyendo PCR, secuenciación y ensamblaje.
  • Producción de productos de PCR utilizando 14 conjuntos de primers de PCR, análisis de secuencias de bases usando 39 primers de secuenciación, formación de contig completo utilizando cada secuencia de datos.
  • Tiempo requerido: 14 días después del control de calidad a la muestra.

SNP

El servicio de análisis de SNPs es altamente flexible para cualquier requerimiento específico del proyecto. Los SNPs (single nucleotide polymorphisms) se producen cada 100 a 300 bases a lo largo del genoma humano y representan aproximadamente el 90% de todas las variaciones genéticas. Los SNPs podrían predisponer a las personas a la enfermedad o la influencia de su respuesta a una droga. Podemos ofrecer un paquete completo de servicios de secuenciación de descubrimientos SNP:

• Optimización PCR
• Amplificación PCR
• Purificación
• Secuencia
• Detección SNP

El análisis SNP de alto rendimiento se realiza usando el ABI3730XL (secuenciador automático de ADN), y el resultado estará disponible aproximadamente en dos (2) semanas.

Construcción de librerías

Macrogen Inc. proporciona varios servicios para analizar el genoma usando el secuenciador ABI 3730XL luego de la construcción de la librería. El secuenciamiento y la librería pueden solicitarse por separado.

Pedido y Resultados
Basados en una base de plantillas de plásmido normal, se garantiza una puntuación phred mayor a 20 (es decir, una probabilidad de llamar erróneamente un nucleótido de 1 en 100. Tenga en cuenta que un puntaje de 30 es una probabilidad de error de 1 en 1000 ya que la escala es logarítmica), y longitudes de lectura (length-reads) mayores a 650 pb.

¿Qué es el puntaje phred?

Un puntaje de calidad Phred es una medida de la calidad de la identificación de las nucleobases generadas por la secuenciación automatizada de ADN. Originalmente fue desarrollado para la llamada de base Phred, un programa de computación diseñado para identificar una secuencia de base (nucleobase) a partir de datos “traza”de fluorescencia generados por un secuenciador de ADN automatizado, el cual utiliza técnicas de electroforesis y métodos de coloración fluorescentes. Cuando se desarrolló originalmente, Phred produjo significativamente menos errores en los conjuntos de datos examinados que otros métodos, promediando un 40-50% menos de errores. Su origen inicial fue para ayudar en la automatización de la secuenciación de ADN en el Proyecto Genoma Humano. Se asignan puntuaciones de calidad de Phred a cada llamada de base de nucleótidos en trazas de secuenciador
automatizadas. Las puntuaciones de calidad de Phred se han aceptado ampliamente para caracterizar la calidad de las secuencias de ADN y pueden utilizarse para comparar la eficacia de diferentes métodos de secuenciación. Quizás el uso más importante de las puntuaciones de calidad de Phred es la determinación automática de secuencias consenso precisas y basadas en calidad.

SERVICIOS

Secuenciación Clásica (Sanger)

  • Tubos o placas
  • Purificación de PCR
  • Amplificación por PCR
  • Optimización de PCR
  • Preparación de plásmidos, cósmidos, fósmidos, BACs.
  • Preparación de gDNA
  • Secuenciación personalizada de regiones complejas
  • Secuenciación de regiones terminales
Secuenciación de nueva generación (NGS, HTS)

  • Secuenciación de genoma completo
  • Secuenciación de panel de cáncer
  • Secuenciación de exoma
  • Secuenciación de transcriptoma
  • Secuenciación de epigenoma
  • Metagenómica
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